シングルセル解析入門

本編ではシングルセル解析初心者の方がテストデータを用いて、 一通りのデータ解析が行えるようになることを目的としています。

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ここでは、トランスクリプトーム解析としてscRNA-seq、 エピゲノム解析としてscATAC-seq解析の方法を説明します。

リンク：シングルセル解析の必要性

リンク：シングルセル解析でできること・問題点

リンク：シングルセル解析の様々なプラットフォーム

ここでは、10x Genomics社のChromiumプラットフォームを用いた 配列データの解析方法について説明します。

Cell Rangerによる処理は多くのコンピュータ資源を必要としますので、高性能計算機の使用をお勧めします。 なおLoupeによる結果の閲覧は、通常のPCで多くの場合問題ありません。

この文書にある処理は東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターのスーパーコンピュータ(HGC)で動作を確認しています。 HGCをご利用になる場合は、以下のメモリ使用指定でqloginしてください。

$ qlogin -l s_vmem=16G,mem_req=16G
							

Rをご使用する場合は、R/3.6以上のバージョンが必要です。 HGCをご利用の場合は、以下のように使用するRを指定してください。

$ module load R/3.6
							

リンク：シングルセル解析の様々なプラットフォーム

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Chromiumを使ったscRNA-seqデータ解析

ここではマウス肺正常細胞のncRNA-seqデータと、解析ツールとしては10x Genomics社のCell Rangerを用いて、一連のパイプラインを処理してみます。

以下の操作について説明します。

1. データの準備・ソフトウェアの確認
2. Cell Rangerによる解析
3. Cell Ranger実行結果の確認
4. Loupe Cell Browserを用いたデータの確認

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Cell Rangerとは

詳しくは以下 (英文)

https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger

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データの準備・ソフトウェアの確認

• cellranger-4.0.0.tar.gz
• refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz

$ mkdir ~/tools/	#Cell Rangerをインストールするためのディレクトリを作成
$ cd ~/tools/	#ディレクトリ内に移動
$ #Cell Rangerのダウンロード
$ curl -o cellranger-4.0.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-4.0.0.tar.gz?Expires=1600871012&Policy=YYYYY&Signature=XXXXX"
$ tar -xzvf cellranger-4.0.0.tar.gz	#解凍・展開
$ mkdir ~/tools/bin/	#ツールの実行ファイルを置くディレクトリを作成しておきます。
$ ln -s ~/tools/cellranger-4.0.0/cellranger ~/tools/bin/

$ #Referenceデータのダウンロード
$ mkdir ~/data/	#Cell Ranger用のリファレンスデータを設置するディレクトリを作成
$ cd ~/data/	#ディレクトリ内に移動
$ #Referenceデータセットをダウンロード
$ curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
$ tar -xzvf refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz	#ダウンロードしたファイルを解凍・展開

$ #Cell Rangerの動作確認
$ #~/tools/bin/にパスを通します
$ export PATH=~/tools/bin:$PATH
$ cellranger
cellranger 4.0.0
Process 10x Genomics Gene Expression, Feature Barcode, and Immune Profiling data

USAGE:
    cellranger <SUBCOMMAND>

FLAGS:
    -h, --help       Prints help information
    -V, --version    Prints version information

SUBCOMMANDS:
    count               Count gene expression and feature barcoding reads from a single sample and GEM well
    vdj                 Assembles single-cell VDJ receptor sequences from 10x Immune Profiling libraries
    aggr                Aggregate data from multiple Cell Ranger runs
    reanalyze           Re-run secondary analysis (dimensionality reduction, clustering, etc)
    targeted-compare    Analyze targeted enrichment performance by comparing a targeted sample to its cognate parent
                        WTA sample (used as input for targeted gene expression)
    targeted-depth      Estimate targeted read depth values (mean reads per cell) for a specified input parent WTA
                        sample and a target panel CSV file
    mkvdjref            Prepare a reference for use with Cell Ranger VDJ
    mkfastq             Run Illumina demultiplexer on sample sheets that contain 10x-specific sample index sets
    testrun             Execute the 'count' pipeline on a small test dataset
    mat2csv             Convert a gene count matrix to CSV format
    mkgtf               Prepare a GTF file for use as a 10x transcriptome reference
    mkref               Prepare a reference for use with 10x analysis software. Requires a GTF and FASTA
    upload              Upload a summary of an analysis pipeline job to 10x Genomics support
    sitecheck           Collect Linux system configuration information
    help                Prints this message or the help of the given subcommand(s)
$
							

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テストデータの準備

$ #マウス肺細胞 Chromium scRNA-seq配列テストデータセットの準備
$ cd ~/data/	#データをダウンロードするディレクトリに移動
$ wget https://kero.hgc.jp/tutorials/learning/data/10X_RNAv3_Lung.tar
$ tar xvf 10X_RNAv3_Lung.tar
							

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Cell Rangerによる解析

$ #適当な作業ディレクトリを作成し移動
$ mkdir ~/analysis_scRNA
$ cd ~/analysis_scRNA
$ #Cell Ranger count(アラインメント・カウント・各種解析(PCA, tSNE/UMAP, クラスタリング, 発現変動遺伝子(DEG)解析)コマンド)を実行します。
$ #引数の意味は以下の通りです
$ #--id: 任意の解析のID
$ #--transcriptome: 10x Genomics社のHPからダウンロードしたreferenceデータセットを展開したディレクトリを指定
$ #--fastqs: chromiumの出力したfastqファイルの入ったディレクトリを指定
$ #--expect-cells: 予想されるシングルセル数(=10000)
$ #--localcores: 解析に使うCPUコア数(ご自身の環境に合わせてなるべく大きな値にしてください)
$ #--localmem: 使用メモリ量(GB)(ご自身の環境に合わせてなるべく大きな値にしてください)
$ cellranger count --id=emm_rnaseq --transcriptome=../data/refdata-gex-mm10-2020-A/ --fastqs=../data/10X_RNAv3_Lung/ --expect-cells=10000 --localcores=8 --localmem=90
$ #...解析完了までお待ちください(上のコマンドはhgcのスーパーコンピュータで処理した場合ですが、6～7時間を要しました)

							

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Cell Ranger 実行結果の確認

$ cd ~/analysis_scRNA/emm_rnaseq/
$ ls
SC_RNA_COUNTER_CS  _filelist    _invocation  _log        _perf       _tags       _uuid     _versions           outs
_cmdline           _finalstate  _jobmode     _mrosource  _sitecheck  _timestamp  _vdrkill  emm_rnaseq.mri.tgz
$ #outsに解析結果ファイルが出力されます
$ cd outs
$ ls
analysis                    filtered_feature_bc_matrix.h5  possorted_genome_bam.bam      raw_feature_bc_matrix.h5
cloupe.cloupe               metrics_summary.csv            possorted_genome_bam.bam.bai  web_summary.html
filtered_feature_bc_matrix  molecule_info.h5               raw_feature_bc_matrix
							

以下のような結果ファイルが出力されます。

File Name	Description
web_summary.html	HTML形式のサマリー。
metrics_summary.csv	CSV形式のサマリー。
possorted_genome_bam.bam	BAMファイル、IGVで閲覧可能。
possorted_genome_bam.bam.bai	BAIファイル。
filtered_feature_bc_matrix	細胞ごとの各遺伝子のUMI数のデータ。filter（UMI数の閾値）をパスした細胞のデータのみ。
filtered_feature_bc_matrix.h5	HDF5形式。細胞ごとの各遺伝子のUMI数のデータ。filterをパスした細胞のみ。
raw_feature_bc_matrix	細胞ごとの各遺伝子のUMI数のデータ。Filterではじかれたデータも含む。
raw_feature_bc_matrix.h5	HDF5形式。細胞ごとの各遺伝子のUMI数のデータ。Filterではじかれたデータも含む。
analysis	DEGや、クラスタリング結果の情報を含むディレクトリ。
molecule_info.h5	Cell Rangerの再解析に使用する。
cloupe.cloupe	Loupe Cell Browser用のファイル。

• web_summary.html
• metrics_summary.csv
• cloupe.cloupe

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結果ファイル web_summary.html

Summaryタグ

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Analysisタグ

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結果ファイル cloupe.cloupe

この結果ファイルから以下のことができます。

• Loupe Cell Browserを使用して、グラフィカルにCell Rangerの結果を可視化することができる。
• 特定細胞集団の抽出や、任意で作成したクラスター間のDEGの検出を行うことができる。
• 詳細な使い方は次のチュートリアルを参考に。What is Loupe Browser?

お使いのクライアントPCにLoupe Cell Browserを以下のURLからダウンロード・インストールしましょう。

https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

cloupe.cloupeファイルをPCにダウンロードしてLoupe Cell Browserで開きましょう。

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アノテーション・細胞種同定

マーカー遺伝子の発現量確認

Cell Marker T cell CD3D, CD3E, CD4, CD8A NK cell CD3(-), NCAM1(CD56), FCGR3A(CD16), Cytotoxic (GNLY, NKG7) B cell CD79A, CD79B, CD19 Monocyte Macrophage CD14, FCGR3A(CD16), CD68

細胞種同定

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Chromiumを使ったscATAC-seqデータ解析

ここではマウス肺正常細胞のncATAC-seqデータと、解析ツールとしては10x Genomics社のCell Ranger ATACを用いて、一連のパイプラインを処理してみます。

以下の操作について説明します。

1. データの準備・ソフトウェア確認
2. Cell Ranger ATACによる解析
3. Cell Ranger ATAC 実行結果の確認
4. Loupe Cell Browserを用いたデータの確認

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Cell Ranger ATACとは

• Alignment: アダプタートリミングをして、BWA-MEMでマッピング
• Duplicate Marking: PCR duplicateリードをチェック
• Peak Calling: ATAC-seqピーク（オープンクロマチン領域）を検出
• Cell Calling: リードがピーク領域にオーバーラップしているリードが一定以上ある細胞を採用
• Peak-Barcode Matrix: ピークと細胞のマトリックスを作成
• Dimensionality Reduction, Clustering, t-SNE Projection: 次元削減（LSA）→ クラスタリング→ 2D可視化
• Peak Annotation: 近傍遺伝子を紐づけ、プロモーター・遺伝子領域のカウント、転写因子結合部位の同定
• Transcription Factor Motif Enrichment Analysis: 各細胞のピークに有意に見出される転写因子モチーフの解析
• Differential Accessibility Analysis: クラスター間における転写因子結合モチーフの違いを解析

詳しくは以下

https://support.10xgenomics.com/single-cell-atac/software/pipelines/latest/algorithms/overview

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データの準備・ソフトウェアの確認

10x Genomics社のダウンロードのページより、 最新版のCell Ranger ATAC(1.2.0)とreferenceデータセット(mouse mm10)(2020/09/23執筆時)をダウンロードします。 ※メールアドレスの登録が必要となります。

• cellranger-atac-1.2.0.tar.gz
• refdata-cellranger-atac-mm10-1.2.0.tar.gz

$ mkdir -p ~/tools/	#Cell Ranger ATACをインストールするためのディレクトリを作成(既に作成してある場合は不要)
$ cd ~/tools/	#ディレクトリ内に移動
$ #Cell Ranger ATACのダウンロード
$ curl -o cellranger-atac-1.2.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-atac/cellranger-atac-1.2.0.tar.gz?Expires=WWWWW&Policy=ZZZZZ&Signature=YYYYY&Key-Pair-Id=XXXXX"
$ tar -xzvf cellranger-atac-1.2.0.tar.gz	#解凍・展開
$ mkdir -p ~/tools/bin/	#ツールの実行ファイルを置くディレクトリを作成しておきます。(既に作成してある場合は不要)
$ ln -s ~/tools/cellranger-atac-1.2.0/cellranger-atac ~/tools/bin/

$ #Referenceデータのダウンロード
$ mkdir -p ~/data/	#Cell Ranger用のリファレンスデータを設置するディレクトリを作成(既に作成してある場合は不要)
$ cd ~/data/	#ディレクトリ内に移動
$ #Referenceデータセットをダウンロード
$ curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-atac/refdata-cellranger-atac-mm10-1.2.0.tar.gz
$ tar -xzvf refdata-cellranger-atac-mm10-1.2.0.tar.gz	#ダウンロードしたファイルを解凍・展開

$ #Cell Rangerの動作確認
$ #~/tools/bin/にパスを通します(既に通してある場合は不要)
$ export PATH=~/tools/bin:$PATH
$ cellranger-atac
cellranger-atac  (1.2.0)
Copyright (c) 2019 10x Genomics, Inc.  All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------

Usage:
    cellranger-atac mkfastq

    cellranger-atac count
    cellranger-atac aggr
    cellranger-atac reanalyze

    cellranger-atac mkref

    cellranger-atac testrun
    cellranger-atac upload
    cellranger-atac sitecheck
$
							

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テストデータの準備

$ #マウス肺細胞 Chromium scATAC-seq配列テストデータの準備
$ cd ~/data/	#データをダウンロードするディレクトリに移動
$ wget https://kero.hgc.jp/tutorials/learning/data/10X_ATAC_Lung.tar
$ tar xvf 10X_ATAC_Lung.tar
							

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Cell Ranger ATACによる解析

$ #適当な作業ディレクトリを作成し移動
$ mkdir ~/analysis_scATAC
$ cd ~/analysis_scATAC
$ #cellranger-atac count(アライメント、ピークコール、解析（次元削減、クラスタリング等）を行うコマンド)を実行します。
$ #--id: 任意の解析のID
$ #--reference: 10x Genomics社のHPからダウンロードしたreferenceデータセットを展開したディレクトリを指定
$ #--fastqs: chromiumの出力したfastqファイルの入ったディレクトリを指定
$ #--localcores: 解析に使うCPUコア数(ご自身の環境に合わせて大きな値にしてください)
$ #--localmem: 使用メモリ量
$ cellranger-atac count --id=emm_atac --reference=../data/refdata-cellranger-atac-mm10-1.2.0/ --fastqs=../data/10X_ATAC_Lung/ --localcores=8 --localmem=90
$ #...解析完了までお待ちください(上のコマンドはhgcのスーパーコンピュータで処理した場合ですが、約1日を要しました)
							

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Cell Ranger ATAC 実行結果の確認

$ cd ~/analysis_scATAC/pbmc_5k_atac
$ cd ~/analysis_scATAC/emm_atac/
$ ls
SC_ATAC_COUNTER_CS  _jobmode           _sitecheck  _versions
_cmdline            _log               _tags       emm_atac.mri.tgz
_filelist           _mrosource         _timestamp  outs
_finalstate         _perf              _uuid
_invocation         _perf._truncated_  _vdrkill
$
$ #outsに解析結果ファイルが出力されます
$ cd outs
$ ls
analysis                    fragments.tsv.gz       raw_peak_bc_matrix
cloupe.cloupe               fragments.tsv.gz.tbi   raw_peak_bc_matrix.h5
filtered_peak_bc_matrix     peak_annotation.tsv    singlecell.csv
filtered_peak_bc_matrix.h5  peaks.bed              summary.csv
filtered_tf_bc_matrix       possorted_bam.bam      summary.json
filtered_tf_bc_matrix.h5    possorted_bam.bam.bai  web_summary.html
							

以下のような結果ファイルが出力されます。

File Name	Description
web_summary.html	HTML形式のサマリー。
summary.csv	CSV形式のサマリー。
possorted_bam.bam	BAMファイル、IGVで閲覧可能。
possorted_bam.bam.bai	BAIファイル。
summary.json	JSON形式のサマリー。
peaks.bed	ピーク領域。
raw_peak_bc_matrix	細胞ごとのPeakのデータ。
raw_peak_bc_matrix.h5	HDF5形式。細胞ごとのPeakデータ。
filtered_gene_bc_matrices	細胞ごとのPeakデータ。filter（閾値）をパスした細胞のデータのみ。
filtered_gene_bc_matrices.h5	HDF5形式。細胞ごとのPeakデータ。filterをパスした細胞のみ。
fragments.tsv.gz	BED-likeの形式。Fragmentの情報。Duplicateは一つにまとめられている。
fragments.tsv.gz.tbi	Fragmentのindexファイル。
filtered_tf_bc_matrix	細胞ごとの転写因子のデータ。
filtered_tf_bc_matrix.h5	HDF5形式。細胞ごとの転写因子のデータ。
analysis	DEGや、クラスタリング結果の情報を含むディレクトリ。
peak_annotation.tsv	Peak領域に遺伝子情報を紐づけたもの。
cloupe.cloupe	Loupe Cell Browser用のファイル。

• web_summary.html
• summary.csv
• cloupe.cloupe

結果ファイル web_summary.html

「?」を押せば各項目の説明を見ることができます。

Loupe Cell Browserを用いた結果の吟味

まだお使いのクライアントPCにLoupe Cell Browserをダウンロード・インストールしてない方は、上記を参考にインストールしましょう。

結果ファイル cloupe.cloupe

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アノテーション・細胞種同定

マーカー遺伝子のAccesibility確認